Clinical application of composite bone graft substitutes

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.022

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Bone defects or non-unions, resulting from osteomyelitis, tumor resection or metabolic disorders, are still a most pressing issue in orthopedic reconstructions which are treated with required bone graft substitutes after clinical comprehensive analysis.

OBJECTIVE: To review the selection and clinical application, experimental research and novel therapeutic approaches for bone graft substitutes and to optimize the applications.

METHODS: PubMed and EMBASE databases were retrieved online for relative articles about the clinical and basic research on bone graft substitute published from 2001-01 to 2012-11, with the key words of “bone regeneration; bone graft substitute; growth factors; biomaterials” in title, abstract and MeSH terms. Articles published recently in authorized journals were preferred, while unrelated and repeated were excluded. Finally, 47 articles were included.

RESULTS AND CONCLUSION: Except for the limitation of graft availability and donor site impairments, autografts exhibit ideal features of bone graft substitutes. On the other hand, allograft harbors the high risk of disease transmission. However, the diversified combined use of bone graft substitutes is considered a morefeasible alternative to augmenting bone regeneration process in which exhibits refined properties, including biomaterials, biodegradable polymers and growth factors and stem cells. Selection and combination of various materials perform multiple effects in bone repair. With good characters of osteoconduction, osteogenesis, and osteoinduction, an ideal bone graft substitutes should possess favorable properties in biomechanical stability and degradation within appropriate duration. Specifically, osteoconduction is determined by composition, structure and surface character. And the other ones embody advantages largely by growth factors and mesenchymal stem cells. Thus, evaluation and indication of bone graft substitutes need to be well weighted to overcome the limitation and to optimize its effect as identical to the normal bone remodeling process as possible.

Key words: biomaterials, biomaterial review, bone regeneration, bone graft substitute, growth factors, biomechanics, stem cells, bone tissue engineering, provincial grants-supported paper

CLC Number:

R318

Huang Xing, Cao Lie-hu, Li Hai-hang, Su Jia-can. Clinical application of composite bone graft substitutes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(34): 6207-6214.

Figures/Tables 1

2.1 自体骨与异体骨性能比较自体骨移植，特别是自体髂骨移植物在目前矫形手术中最常用，无免疫排斥反应，并具有骨诱导、骨传导和成骨作用[1] ，成为判断其他骨移植物性能的金标准。自体骨皮质移植物可掺入宿主骨缺损区，生物相容性良好并提供生物力学结构支持。然而自体移植骨的缺点亦然：增加新手术伤口；数量和利用度有限；手术时间延长；神经损伤；出血量增加；麻醉时间延长；供区并发症诸如感染；出血过多等手术风险[2-3] 。此外，供区慢性疼痛，瘢痕及儿童可供骨面积少等特点同样是应用的局限。对于长骨缺损修复修复不能满足供骨数量。异体骨组织缺少细胞成分，只存在较弱的骨诱导和骨传导能力，适用于幼儿、老年人、手术风险大及无法获取足够多的移植骨患者。由于异体骨来源广，增加了免疫排斥反应及传播疾病的风险，对于深冻骨和冻干骨也不能排除此风险。 2.2 植骨替代材料合适的骨移植取代物支架主要分为2种，一为生物材料，如珊瑚[4] 、天然多聚物Ⅰ型胶原、藻酸盐、纤维蛋白、脱钙骨基质[5] 、壳聚糖等，二为合成材料，如多孔金属、生物活性玻璃、生物陶瓷(羟基磷灰石、磷酸三钙、硫酸钙等)、高分子材料(多聚乳酸、聚乙醇酸和乳酸羟基乙酸共聚物)等。支架复合物的表面特点、几何构型、孔径等因素均影响骨传导特性[6] 。也可根据骨移植材料的吸收性分为可生物降解型和非生物降解型。临床应用中使用较多的是生物陶瓷类和高分子材料。三磷酸钙化学计量与无定型的前体骨相似，透明质酸则与骨矿物化学计量相似，所以三磷酸钙与透明质酸具有自体骨一般的特性，且透明质酸材料具有机械支持特性。单独使用生物陶瓷并无骨诱导特性，当与自体骨结合时，类骨质很快于其表面附着生长。最终类骨质矿化，新骨生成。三磷酸钙与透明质酸材料生物相容性良好，多孔表面允许周边骨细胞快速迁移，破骨细胞吸收降解材料，成骨细胞促进新骨生长。几乎所有植骨材料都经历爬行取代过程，最终促进骨修复。 2.3 组织工程复合骨组织工程为学科交叉领域，结合工程学原理和生物基础研究，通过生物材料、细胞、信号分子等途径修复骨缺损，介导骨细胞迁移，增生，分化及血管生成。因此，应用组织工程需要满足3个指标：能在骨修复过程中可控的传递生长因子；能募集和传递骨细胞；能运用合适的支架安全、可靠、有效的负载细胞及生长因子。随着对骨愈合分子水平和细胞水平认知提升，相对自体移植骨而言，复合骨可以根据实际情况优选组织工程种子细胞和生长因子，并结合大量动物实验，其运用已取得进步。目前为止，临床上已有7例运用细胞扩增传系非基因修饰的间充质干细胞治疗骨缺损，其中2例应用于长骨，5例于上颌及面部。此外，该方法可以加速骨折的愈合的过程，防止全关节置换后的无菌性松动，在治疗方面高效安全[7] 。 2.3.1 生物活性物质复合骨脱钙骨基质：脱钙骨基质具有骨诱导和骨传导特性，应用广泛。起初脱钙骨基质无结构支持力，适用于结构稳定的骨环境中。由于在脱矿化过程中保留了细胞外基质存留的多种生长因子及蛋白，重建骨质可快速再血管化，不引起机体对移植物抗宿主的免疫反应，优势明显。再者，脱钙骨基质表面积广，适合细胞迁移附着。然而，脱钙骨基质缺乏稳定性，手术后易从移植部位迁移，而且骨诱导受储存、加工、灭菌过程干扰。为弥补其缺陷，多种天然或合成材料复合脱钙骨基质可优化性能，比如天然生物多聚物壳聚糖复合脱钙骨基质。壳聚糖在生理pH环境下易降解，Chenite等[8]于此基础上加入了β-甘油磷酸酯制成中性温敏凝胶壳聚糖溶液，性能趋于稳定，但结构组成、分子量、乙酰化程度等未作相应研究。Tian等[9]则通过扫描电镜、孔径测定、机械力测试、体内试验降解率等测定，选择在温敏凝胶壳聚糖载体中加入脱钙骨基质的比率，通过凝固速率的分析，显示选用壳聚糖复合物2∶1的脱钙骨基质/9%与β-甘油磷酸酯的壳聚糖可作为理想的复合骨移植替代物。在临床应用方面，脱钙骨基质可填充因骨脓肿造成的骨缺损、重建上颌面骨及桥接长骨骨缺损。其中，应用Mg-透明质酸-脱钙骨基质纳米复合物填充因弓形腿行高位胫骨截骨的患者，通过放射学、组织形态测定法及对关节功能评分与术后骨接合效果进行比较，6周以后发现应用Mg-透明质酸-脱钙骨基质纳米复合物的9例患者相比于植入冻干骨片的其他患者而言，前者骨融合率增加明显，成骨活性高，但试验组材料不可吸收[10] 。无论在基础研究和临床试验结果中，显示植骨对于骨愈合均有积极作用，其中天然生物多聚物壳聚糖复合脱钙骨基质和Mg-透明质酸-脱钙骨基质纳米骨等复合植骨材料可快速促进修复过程，复合骨比单一应用而言更为可行，损伤小，医疗资源可更加地优化利用。胶原：骨组织形成过程中Ⅰ型胶原由成骨细胞合成，是骨基质中的重要成分，对于骨形态发生蛋白载体材料的选择其中最重要的天然聚合物就是胶原，其被视为骨形态发生蛋白支架材料金标准，原因如下：骨形态发生蛋白与胶原交联亲和力高；从牛骨及肌腱中提取的Ⅰ型胶原容易获取，组织相容性强。所以胶原支架材料的设计和处理极大影响骨形态发生蛋白的药代动力学。体内试验表明植入骨形态发生蛋白/胶原后降解快，置留时间短等成为此材料使用的缺点。其一，加入羧甲基纤维素的骨形态发生蛋白7/胶原复合骨有良好的稳定性与可控性[11] 。再者骨形态发生蛋白/胶原复合物中加入肝素可促进二者的融合，并防止纤溶酶裂解作用对骨形态发生蛋白质和量的影响，体内试验和体外实验均显示肝素对于稳定骨形态发生蛋白性能的积极作用[12] 。其二，为模拟天然骨形成过程，合成骨取代物需具备可控的胶原基质矿化反应，具备相应的生物力学强度。针织骨纳米胶原拟生态复合物材料，运用碳二亚胺促交联和加压操作等方法，使浓集的胶原塑形，并采取多聚物诱导的液态前体矿化过程准备胶原-透明质酸复合物，结果发现胶原交联膜刺激矿化反应，提升了胶原的生物力学作用[13] 。以上胶原复合骨的优化不仅稳定了骨形态发生蛋白的性质，而且在生物力学要求的满足，结合其生物的可相容性等特点，胶原材料可以不断的改良，扩大临床应用，指导了下一代拟生态复合骨生物材料的进一步研究。 2.3.2 生长因子复合骨生长因子的使用带来众多优良特性，避免自体骨供区受损带来并发症；重组合成技术的更新促进产出，不受供应数量局限；用量可控，与自体髂骨移植物结合应用效果佳。目前研究最为深入的仍属骨形态发生蛋白，结合其他生长因子的研究，在前期临床或临床试验观察评估下，理想而又可使其效应优化的重组合成因子需要突破性的探索研究支撑[14] ，以下将讨论目前就有潜在研究价值的因子。骨形态发生蛋白：提升植骨的骨传导性常用方法即在其中载入生物活性分子。活性因子表达由骨基质和在骨缺损愈合过程中诱导，以促进骨细胞成骨及再血管化，促进骨组织修复愈合。常见的生长因子包括骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、转化生长因子β、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子等[15] 。自Urist[16]1965年发现骨形态发生蛋白以来，1988年Wozney等复制了骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4的cDNA，并证实骨形态发生蛋白属于转化生长因子β的超家族。临床上现仅有2种准许使用的骨形态发生蛋白，分别为重组人骨形态发生蛋白2 (InfuseTM, Medtronic Sofamor Danek Inc.,Minneapolis, MN, USA) 和重组人骨形态发生蛋白7 (OP-1TM, Stryker Biotech, Hopkinton, MA, USA)，在骨不连、骨缺损、开放性胫骨骨折及椎体融合方面均有临床相应研究[17-18] 。成釉细胞瘤、骨髓炎造成的骨缺损中，Clokie 等[19]应用生物材料负载脱钙骨基质与骨形态发生蛋白7治疗10例下颌骨缺损效果良好；Li等[20]应用重组人骨形态发生蛋白2、明胶微球和磷酸钙骨水泥在实验动物上比较重组人骨形态发生蛋白2/磷酸钙骨水泥复合物移植，将两者浸入体液中28 d，检测重组人骨形态发生蛋白2的释放。然后植入骨质疏松的羊骨中45 d和140 d，形态学及力学测试表明重组人骨形态发生蛋白2/明胶微球/磷酸钙骨水泥新型材料重组人骨形态发生蛋白2释放量大于重组人骨形态发生蛋白2/磷酸钙骨水泥复合物，28 d后的监测分别为(37.8±2.3)%和(14.7± 1.9)%。上述研究表明生物材料种类选择可直接影响骨修复的质量，明胶微球和磷酸钙骨水泥材料均控制骨形态发生蛋白释放速率，脱钙骨基质则保留细胞外基质多种生长因子及蛋白，分别从不同的角度对骨形态发生蛋白进行控释。重组人骨形态发生蛋白2椎体融合方面效果良好，但是存在相当的合并症和重组人骨形态发生蛋白2相关的不良反应，Robin等[21]报道1例后路脊柱减压融合术后2次手术冲洗反复发生的血清肿；Helgeson等[22]在腰椎部位应用重组人骨形态发生蛋白2具有83%融合率，当时气其导致的骨质溶解作用却高达54%；其他研究报告显示椎体术后神经根炎发生率有不同水平增加[23-24] 、异位骨组织的形成、弥漫的软组织肿胀等各型并发症，尽管以上所述并发症并非重组人骨形态发生蛋白2特异相关，但相比于自体髂骨的取用所致并发症而言，其发生率出现递增。由于前期有关骨形态发生蛋白商业资助相关研究的开展夸大了重组人骨形态发生蛋白“无应用风险”的特点[25-26] ，因理想的临床数据结论支持，促使了其在脊柱外科广泛的应用，由2002年的0.7%到2007年>50%的腰椎体前路手术使用率和43%后路椎体融合术应用率[27-28] 。尽管现今大量针对重组人骨形态发生蛋白的研究正在开展，是否每一例骨缺损或融合术均需要使用重组人骨形态发生蛋白，还是自体髂骨移植物使用优于重组蛋白，此方面结果仍然需要循证医学证据的考量。其他生长因子：成纤维细胞生长因子与血小板源性生长因子在早期促进骨生成，且实验证实成纤维细胞生长因子与骨形态发生蛋白共同应用促进了细胞有丝分裂和血管的形成。血管内皮生长因子在动物实验中显示其具有加速血管生成和骨组织更新的作用，当血管内皮生长因子结合骨形态发生蛋白应用在骨折损伤修复过程具有显著地综合作用[29]。而凝血酶多肽TP508刺激细胞生成，在血管形成过程启动、再血管化、表皮修复和肌肉组织的修复方面上作用明显[30] 。重组人源生长和分化因子重组人GDP-5复合β-三磷酸钙或MD05在鼠颅骨缺损模型中显示骨形成速率是其他复合骨的5倍[31] 。目前大部分生长因子对骨形成过程中的机制尚未明确，仍需长期的基础及临床研究[32]，如何选择合适的单一生长因子或复合生长因子、剂量、浓度、载体等问题成为生长因子优化应用的方向。 2.3.3 血小板富集血清复合骨血小板富集血清采集于患者自体血液，浓度较高，近年来应用血小板富集血清种植复合骨治疗并修复骨折效果明显。运用血小板富集血清的目标即是释放生长因子，相比其他如骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7等骨传导介质，血小板富集血清源于自身供体，具有无过敏及移植物抗宿主反应的特点。再者，血小板富集血清中生长因子种类丰富，包括血小板源性生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子1、血小板因子4等[33] 。其作用于皮质骨区域，对于骨再生作用机制有两个方面优势：通过提高干细胞的数量和活力，使细胞自身释放转化生长因子β；再而刺激巨噬细胞和间充质干细胞的化学趋化与活化，在骨愈合过程中逐步取代血小板[34] 。在运用血小板富集血清结合自体骨移植物治疗长骨干骺端25 mm深的骨缺损模型中，小型猪8只植入自体骨作为对照，其余8只植入载血小板富集血清的自体骨，血小板富集血清中血小板的浓度为正常血的4.9倍，6周以后标本经过组织学与X射线检测，组织形态学分析显示实验组骨缺损中心区和皮质区新骨形成再生完全，特定观察区域骨桥半定量测量显示血小板富集血清组明显优于对照组[35] ；珊瑚可与血小板富集血清复合(Coral-hPRP)植入兔子深10 mm，直径4 mm的桡骨干中段圆柱形缺损，组织学评分Coral-hPRP组显著优于对照组，而且生物力学方面差异有显著性意义[36] ；应用羟基磷灰石材料与血小板富集血清异位骨膜下移植在实验猪体内证实有促进体内骨生成的作用[37] 。通过自体骨、珊瑚及羟基磷灰石材料不同层面结合血小板富集血清运用，表明血小板富集血清种植骨及复合骨替代物促进骨缺损修复。血小板富集血清与重组生长因子结合种植于生物骨材料中，模拟生理微环境下重塑过程，显示出优良特性，而且血小板富集血清浓集与血制品，方法简便经济，能够释放多种生长因子。但是血小板富集血清结合植骨物质、合成生物材料或源于骨髓的间充质干细胞，由于缺乏骨诱导性，在实验和临床应用方面值得深入探究[38-39] 。 2.3.4 细胞移植复合骨干细胞种植复合骨：细胞移植可直接分化为骨形成细胞或诱导形成其他细胞从而构建骨组织。目前，可分化为前成骨细胞或成熟成骨细胞的移植物是间充质干细胞。间充质干细胞源于中胚层，在胚胎发生过程中形成机体大部分骨骼结构，可自我更新稳定或修复骨及软骨组织，在组织工程方面有较大的应用价值。现有的间充质干细胞提取物主要源于自体骨髓提取、海绵骨、脂肪组织、滑液膜或骨膜等多种途径。提取最优选择是从骨髓中提取，可用于肌腱、韧带、肌肉、软骨和骨组织的再生。考虑到细胞数量不足等问题，对间充质干细胞获得的取代方法在积极研究中。体内扩增实验成为较有前景的方法，此方法可以生成大量活性良好的前体细胞，解决了细胞的质量问题；不足之处同样不可避免，此种需要二期手术的方法增加了细菌和病毒感染的风险，耗时，且相应的成本增高。多种间充质干细胞与植骨支架结合用于修复长骨缺损为探讨人间充质干细胞对骨生成诱导潜能，在弱免疫反应的动物皮下异体植入间充质干细胞种植的透明质酸、透明质酸/三磷酸钙或β-三磷酸钙等支架骨材料[40] ，结果显示体内成骨易受移植间充质干细胞活性的影响，因年龄、提取部位、技术应用等因素而造成细胞的浓度及质量方面存在差异。目前，应用非基因修饰而采取扩增方式得到的间充质干细胞已应用于7例人体试验，2例于长骨，5例于上颌骨，但不能据此来判断细胞支架骨已发展成熟，干细胞在再生医学领域应用潜能广泛，但具体明确的作用机制需进一步阐明以利于干细胞在靶点发挥相应作用。基因工程复合骨：区别于传统骨移植物和直接注入生长因子的复合人工骨，基因疗法是一种非常理想而具有潜力发展的新型植骨替代方式。基因工程研究骨再生修复目的在于选择合适的质粒在靶细胞位点上稳定长效的表达蛋白和生长因子等物质促进组织再生。编码基因可直接导入靶细胞，使宿主细胞转染直接体内表达成骨活性的蛋白因子，或者选择体外转导的骨祖细胞系分化培养细胞并种植在再生部位[41-42] 。满足要求的重组质粒应该具备如下特点：有效并特异地到达靶位点；基因表达严格控制，有着特定的“开关”机制；质粒允许修饰基因在骨修复全过程稳定的表达；对机体无副作用。血管内皮生长因子与骨形态发生蛋白2两种生长因子转染的骨髓间充质干细胞具有促进骨再生作用[43] ，结果显示转染2种生长因子的复合骨骨盐沉积率明显高于单一转染或非转染的骨髓间充质干细胞种植珊瑚复合骨。除此以外，碱性成纤维细胞生长因子转染的间充质干细胞种子在多孔β-三磷酸钙支架上表现出促进血管和骨组织生成的活性[43] 。基因工程复合骨应用对加速骨愈合方面显现出优势潜力，未来可针对长骨骨缺损、萎缩性骨不连、缺血性股骨头坏死等临床上难以解决的问题提供新的选择和治疗研究方向，从而评估使用的有效性、安全性、转染方式选择优化等问题。"

References

[1]Samartzis D, Shen FH, Goldberg EJ, et al. Is autograft the gold standard in achieving radiographic fusion in one-level anterior cervical discectomy and fusion with rigid anterior plate fixation. Spine (Phila Pa 1976). 2005; 30(15): 1756-1761.

[2]Putzier M, Strube P, Funk JF, et al. Allogenic versus autologous cancellous bone in lumbar segmental spondylodesis: a randomized prospective study. Eur Spine J. 2009;18(5): 687-695.

[3]Chatterjea A, Meijer G, van BC, et al. Clinical application of human mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering. Stem Cells Int. 2010; 2010: 215625.

[4]Demers C, Hamdy CR, Corsi K, et al. Natural coral exoskeleton as a bone graft substitute: a review. Biomed Mater Eng. 2002;12(1): 15-35.

[5]Wildemann B, Kadow-Romacker A, Haas NP, et al. Quantification of various growth factors in different demineralized bone matrix preparations. J Biomed Mater Res A. 2007;81(2): 437-42.

[6]Kasten P, Beyen I, Niemeyer P, et al. Porosity and pore size of beta-tricalcium phosphate scaffold can influence protein production and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells: an in vitro and in vivo study. Acta Biomater. 2008; 4(6): 1904-1915.

[7]Kim SJ, Shin YW, Yang KH, et al. A multi-center, randomized, clinical study to compare the effect and safety of autologous cultured osteoblast(Ossron) injection to treat fractures. BMC Musculoskelet Disord. 2009; 10: 20.

[8]Chenite A, Chaput C, Wang D, et al. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ. Biomaterials. 2000; 21(21): 2155-2161.

[9]Tian M, Yang Z, Kuwahara K, et al. Delivery of demineralized bone matrix powder using a thermogelling chitosan carrier. Acta Biomater. 2012;8(2): 753-762.

[10]Dallari D, Savarino L, Albisinni U, et al. A prospective, randomised, controlled trial using a Mg-hydroxyapatite - demineralized bone matrix nanocomposite in tibial osteotomy. Biomaterials. 2012;33(1): 72-79.

[11]Cook SD, Salkeld SL, Patron LP. Bone defect healing with an osteogenic protein-1 device combined with carboxymethylcellulose. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005;75(1): 137-145.

[12]Zhao B, Katagiri T, Toyoda H, et al. Heparin potentiates the in vivo ectopic bone formation induced by bone morphogenetic protein-2. J Biol Chem. 2006;281(32): 23246-23253.

[13]Li Y, Thula TT, Jee S, et al. Biomimetic mineralization of woven bone-like nanocomposites: role of collagen cross-links. Biomacromolecules. 2012;13(1): 49-59.

[14]Nauth A, Ristevski B, Li R, et al.Growth factors and bone regeneration: how much bone can we expect. Injury. 2011; 42(6): 574-579.

[15]Dimitriou R, Tsiridis E, Giannoudis PV. Current concepts of molecular aspects of bone healing. Injury. 2005;36(12): 1392-1404.

[16]Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science (80- ). 1965;150(3698): 893-899.

[17]Boakye M, Mummaneni PV, Garrett M, et al. Anterior cervical discectomy and fusion involving a polyetheretherketone spacer and bone morphogenetic protein. J Neurosurg Spine. 2005;2(5): 521-525.

[18]Dawson E, Bae HW, Burkus JK, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 on an absorbable collagen sponge with an osteoconductive bulking agent in posterolateral arthrodesis with instrumentation. A prospective randomized trial. J Bone Joint Surg Am. 2009;91(7): 1604-1613.

[19]Clokie CM, Sandor GK. Reconstruction of 10 major mandibular defects using bioimplants containing BMP-7. J Can Dent Assoc. 2008;74(1): 67-72.

[20]Li M, Liu X, Liu X, et al. Calcium phosphate cement with BMP-2-loaded gelatin microspheres enhances bone healing in osteoporosis: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 2010;468(7): 1978-1985.

[21]Robin BN, Chaput CD, Zeitouni S, et al. Cytokine-mediated inflammatory reaction following posterior cervical decompression and fusion associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2: a case study. Spine (Phila Pa 1976). 2010;35(23): E1350-1354.

[22]Helgeson MD, Lehman RA Jr, Patzkowski JC, et al. Adjacent vertebral body osteolysis with bone morphogenetic protein use in transforaminal lumbar interbody fusion. Spine J. 2011; 11(6): 507-510.

[23]Rihn JA, Patel R, Makda J, et al. Complications associated with single-level transforaminal lumbar interbody fusion. Spine J. 2009;9(8): 623-629.

[24]Carragee EJ, Hurwitz EL, Weiner BK. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 2011;11(6): 471-491.

[25]Dawson E, Bae HW, Burkus JK, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 on an absorbable collagen sponge with an osteoconductive bulking agent in posterolateral arthrodesis with instrumentation. A prospective randomized trial. J Bone Joint Surg Am. 2009;91(7): 1604-1613.

[26]Dimar JR 2nd, Glassman SD, Burkus JK, et al. Clinical and radiographic analysis of an optimized rhBMP-2 formulation as an autograft replacement in posterolateral lumbar spine arthrodesis. J Bone Joint Surg Am. 2009;91(6): 1377-1386.

[27]Carragee EJ, Bono CM, Scuderi GJ. Pseudomorbidity in iliac crest bone graft harvesting: the rise of rhBMP-2 in short- segment posterior lumbar fusion. Spine J. 2009. 9(11): 873-879.

[28]Howard JM, Glassman SD, Carreon LY. Posterior iliac crest pain after posterolateral fusion with or without iliac crest graft harvest. Spine J. 2011;11(6): 534-537.

[29]Peng H, Usas A, Olshanski A, et al. VEGF improves, whereas sFlt1 inhibits, BMP2-induced bone formation and bone healing through modulation of angiogenesis. J Bone Miner Res. 2005;20(11): 2017-2027.

[30]Wang H, Li X, Tomin E, et al. Thrombin peptide (TP508) promotes fracture repair by up-regulating inflammatory mediators, early growth factors, and increasing angiogenesis. J Orthop Res. 2005;23(3): 671-679.

[31]Poehling S, Pippig SD, Hellerbrand K, et al. Superior effect of MD05, beta-tricalcium phosphate coated with recombinant human growth/differentiation factor-5, compared to conventional bone substitutes in the rat calvarial defect model. J Periodontol. 2006;77(9): 1582-1590.

[32]Nauth A, Giannoudis PV, Einhorn TA, et al. Growth factors: beyond bone morphogenetic proteins. J Orthop Trauma. 2010;24(9): 543-546.

[33]Wrotniak M, Bielecki T, Gazdzik TS. Current opinion about using the platelet-rich gel in orthopaedics and trauma surgery. Ortop Traumatol Rehabil. 2007;9(3): 227-238.

[34]Pierce GF, Tarpley JE, Yanagihara D, et al. Platelet-derived growth factor (BB homodimer), transforming growth factor-beta 1, and basic fibroblast growth factor in dermal wound healing. Neovessel and matrix formation and cessation of repair. Am J Pathol. 1992;140(6): 1375-1388.

[35]Hakimi M, Jungbluth P, Sager M, et al. Combined use of platelet-rich plasma and autologous bone grafts in the treatment of long bone defects in mini-pigs. Injury. 2010;41(7): 717-723.

[36]Parizi AM, Oryan A, Shafiei-Sarvestani Z, et al. Human platelet rich plasma plus Persian Gulf coral effects on experimental bone healing in rabbit model: radiological, histological, macroscopical and biomechanical evaluation. J Mater Sci Mater Med. 2012;23(2): 473-483.

[37]Metzler P, von Wilmowsky C, Zimmermann R, et al. The effect of current used bone substitution materials and platelet-rich plasma on periosteal cells by ectopic site implantation: an in-vivo pilot study. J Craniomaxillofac Surg. 2012; 40(5): 409-415.

[38]Giovanini AF, Gonzaga CC, Zielak JC, et al. Platelet-rich plasma (PRP) impairs the craniofacial bone repair associated with its elevated TGF-beta levels and modulates the co-expression between collagen III and alpha-smooth muscle actin. J Orthop Res. 2011;29(3): 457-463.

[39]Bassi AP, Carvalho PS. Repair of bone cavities in dog's mandible filled with inorganic bovine bone and bioactive glass associated with platelet rich plasma. Braz Dent J. 2011;22(1): 14-20.

[40]Janicki P, Kasten P, Kleinschmidt K, et al. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomater. 2010;6(8): 3292-3301.

[41]Dimitriou R, Jones E, McGonagle D, et al. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 2011;9: 66.

[42]Fischer J, Kolk A, Wolfart S, et al. Future of local bone regeneration - Protein versus gene therapy. J Craniomaxillofac Surg. 2011;39(1): 54-64.

[43]Guo X, Zheng Q, Kulbatski I, et al. Bone regeneration with active angiogenesis by basic fibroblast growth factor gene transfected mesenchymal stem cells seeded on porous beta-TCP ceramic scaffolds. Biomed Mater. 2006;1(3): 93-99.

[44]Devescovi V, Leonardi E, Ciapetti G, et al. Growth factors in bone repair. Chir Organi Mov. 2008;92(3): 161-168.

[45]Schmidmaier G, Schwabe P, Strobel C, et al. Carrier systems and application of growth factors in orthopaedics. Injury. 2008; 39 Suppl 2: S37-43.

[46]Giannoudis PV, Einhorn TA, Schmidmaier G, et al. The diamond concept--open questions. Injury. 2008;39 Suppl 2: S5-8.

[47]Chen Z, Ba G, Shen T, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 versus autogenous iliac crest bone graft for lumbar fusion: a meta-analysis of ten randomized controlled trials. Arch Orthop Trauma Surg. 2012;132(12): 1725-1740.